DNA-analys

Analys av DNA

I brottsmålsundersökningar och/eller i identifieringsärenden används DNA profiler inte ensamt utan tillsammans med andra typer av analyser. I Sverige får man inte fälla någon brottsling bara med hjälp av DNA bevisning utan personer kan endast frias från misstanke. Beroende på vilken utredning som görs kan man från hår, fingeravtryck, läppavtryck, blod, spermier, saliv, vävnadsprov, ben, urin avföring utvinna DNA. DNA analyser kan sedan skilja personer ifrån varandra, undantag är enäggstvillingar. Ett annat undantag är personer som har benmärgstransplanterats som kommer att ha olika DNA profiler beroende på om man undersöker vävnads- eller blodprov.

Varför använder man sig av DNA-analyser?

• Regioner i vårt DNA är hypervariabelt vilket innebär att det går att skilja personer ifrån varandra
• DNA-molekylen är stabil vilket gör att "kvarlevor" t ex från öppnade gravar går att undersöka
• Det räcker med en "kvarlämnad" cell på en brottsplats för att en DNA analys ska kunna utföras
• Tekniker är snabb och relativt billig
• Idag finns DNA profiler lagrade i databaser framtagna ifrån olika typer av brottsplatser (våldsbrott, inbrott etc), vilket innebär att man långt efter att ett brott har begåtts har möjlighet att finna den skyldige

Genotyp - en individs genetiska sammansättning. Olika varianter av en gen kallas för alleler.  Fenotyp - "det man ser" (det som uttrycks). Exempel, genen för blodgruppssystemet AB0 har tre alleler, nämligen I^A, I^B samt i. En individ kan uttrycka någon av fenotypklasserna;

blodgrupp A (genotyp I^A I^A eller I^A i)

blodgrupp B (genotyp I^B I^B eller I^Bi)

blodgrupp AB (genotyp I^A I^B)

blodgrupp 0 (genotyp ii)

Är man t ex I^A I^A eller I^B I^B är man homozygot, har man två olika alleler t ex I^A i är man heterozygot.

Gener är den del av vår DNA-kedja som "kodar för något", en biokemisk instruktion till hur ett protein ska se ut. Vi ärver en genkopia från vår mamma och en från vår pappa. Genens instruktion kan förändras om någon av baserna ändras (A ändras till C), en mutation har skett och en ny allel har uppkommit.

DNA-strukturen

DNA- molekylen ser ut som en stege (en dubbel helix) och är sammansatt av nukleotider, vilka består av fosfat, femkolsocker (deoxiribos) och en av de organiska baserna (cytosin, C; guanin, G; tymin. T; samt adenin, A). Nukleotiderna hålls samman av fosfodiesterbindningar.  A basparar alltid med T och C basparar alltid med G under normala förhållanden, bindningarna mellan baserna är vätebindningar. Kombinationen av dessa fyra baser ger oss alla de olika gener som gör oss till människor och alla andra organismer som finns på jordklotet (undantag är de mikroorganismer vars arvsmassa består av RNA).

Vår arvsmassa (genom) består av 3,2 x 10⁹ baser.

DNA organisationen

Vår arvsmassa i cellkärnan är organiserad i 46 kromosomer, hälften har vi fått från vår mamma och hälften från vår pappa. Kromosom 1-22 kallas för autosomer och de kromosomer som bestämmer könet benämns könskromosomer (XX för kvinnor och XY för män). Den största kromosomen har fått nummer 1 och den minsta borde ha fått numret 22, men en felbestämning gjorde att vår kromosom 21 är den minsta. Albert Levan, verksam i Lund är en av de forskare som visade att vi har 46 kromosomer. I våra könsceller, vilka benämns gameter (ägg respektive spermier) har vi endast halva kromosomantalet (haploida celler).

I andra kroppsceller har vi däremot 46 kromosomer (diploida celler). Mycket av vårt DNA är icke-kodande (intergenic DNA) och ger inget fenotypiskt uttryck. Hos högre organismer, typ människor, är generna uppsplittrade i exoner (kodande) och introner (icke-kodande). Genom en rad processer sätts sedan dessa exons information ihop till mRNA som sedan omvandlas till ett protein.  Bortsett från att vi har arvsmassa i cellkärnan finns det också DNA i våra mitokondrier (cellens energifabrik). Mitokondrie-DNAt (mtDNA) är cirkulärt och är 16 569 bp långt.

I mycket påminner mtDNAt om bakteriers DNA, vilket bevisar att mitokondrien har ett bakterieursprung. Mitokondrierna finns i cellens cytoplasma. På grund av spermiens ringa storlek, saknas i princip cytoplasma vilket medför att vi ärver all cytoplasma från vår mamma.

Loci

Positionen på kromosomen av en viss gen eller sekvens av DNA kallas för lokus (pl loci). Att olika alleler uppkommer kan bero på att man utsätts för kemikalier eller strålning men beror oftast på att fel introduceras då DNA-kedjan replikeras (fördubblas) inför celldelning. I vår arvsmassa finns en typ av sekvenser som kalls för tandem repeterat DNA. Detta är sekvenser som finns upprepat och ligger direkt efter varandra, t ex ATATAT eller (ATGA)_n. Beroende på hur långa dessa sekvenser är kallar man det för olika namn (STRs eller mikrosatelliter, VNTRs eller minisatelliter samt satellit DNA).

När DNA polymeras ska kopiera upp dessa tandemrepeterade sekvenser händer det att det kopieras upp +1 upprepning eller -1 upprepning. Det är just dessa missar som gör att det finns så stor variation i vissa delar av vårt genom och det är denna variation man utnyttjar då man studerar DNA profiler. Dessa multivariabla regioner finns i princip alltid i icke-kodande regioner, vilket innebär att det inte har någon betydelse för en individ om den har 7 eller 10 upprepningar av en repeterad sekvens. Detta benämns som att sådana multivariabla loci är selektivt neutrala.

Det finns några sjukdomar som beror på att en repeterad sekvens finns i för stort antal i en gen, vilket leder till att genen inte fungerar. Exempel på sjukdomar är Huntingtons syndrom, Fragilt X syndrom etc. DNA profiler utförs i dag på de multivariabla regioner som benämns mikrosatelliter. DNA är stabilt vilket innebär att man i princip kan lagra det i rumstemperatur. Det är vanligast att man förvarar DNA i kyl eller om det ska lagras under lång tid, förvaras det i frys. Framtagandet av DNA är oftast en enkel process genomförd på ca en timme. Vissa material är bättre än andra då man ska utvinna DNA.

Polymerase chain reaction (PCR)

Denna metod är ett sätt att mångfaldiga mängden DNA och att mångfaldiga just de regioner som är multivariabla. Metoden bygger på användningen av ett enzym, DNA polymeras, som är extremt värmetåligt. Enzymet används i en cyklisk process för att mångfaldiga ett bestämt DNA fragment. Vilket fragment som skall amplifieras bestäms av två sekvensspecifika primers som binder in till flankerna av det utvalda fragmentet. I denna applikation binder de enkelsträngade DNA-sekvenserna (primers) in till regionen precis utanför själva mikrosatelliten.

Dessa primers tjänar sedan som startpunkt för DNA polymeraset. För att en ny DNA kedja ska kunna byggas upp krävs också att de fyra baserna finns närvarande i reaktionen. Först denatureras det DNA som skall undersökas vid en hög temperatur (ca 95-98C) detta leder till att det genomiska DNAt blir enkelsträngat eftersom vätebindningarna inte förmår hålla ihop den dubbla helixen vid så höga temperaturer. Nästa steg är att temperaturen sänks ner till ca 45-50C. Vi denna temperatur kommer primers att binda in till sina komplementära sekvenser. Därefter höjs temperaturen igen till 72C, som är enzymets optimum och där alltså syntesen av en ny komplementär sträng sker.

Eftersom tillväxten är exponentiell med 2 finns det miljontals kopior av fragmentet redan efter ett 30-tal cykler (Fig 6.6). Amplifieringen utförs av DNA polymeras I från Thermus aquaticus. Denna organism lever i heta källor och det är därför inte svårt att förstå varför dess DNA polymeras är så värmetåligt. Vanligen amplifieras DNA fragment som är ganska korta, mindre än 1 kb, men det går att amplifiera fragment som är upp till 10 kb långa.

• Primers - är de för korta kan ospecifik inbindning ske. Om en ´8-mer´med slumpmässigt vald DNA sekvens hybridiseras till det humana genomet kommer den i medeltal (om vi antar att varje bas har samma sannolikhet att väljas i varje position) att hybridisera till genomet varje 4⁸ =65536 bp. En sådan sekvens binder alltså slumpmässigt in till ca 50 000 ställen i genomet. Därför används för det mesta primers som är 15 - 25 baser långa, då dessa minskar risken för ospecifik inbindning till andra sekvenser än målsekvensen.
• Temperatur - en hög inbindningstemperatur kräver ju att komplementariteten mellan primer och målsekvens är perfekt men medför å andra sidan att färre molekyler faktiskt förmår binda in till den korrekta målsekvensen. En lägre inbindningstemperatur ökar ospecificiteten och man riskerar att amplifiera andra sekvenser än målsekvensen.
• Koncentrationer - specificiteten bestäms i hög grad av koncentrationerna av de komponenter som ingår i reaktionen. Koncentrationerna primer, polymeras, Mg-joner och target DNA är alla betydelsefulla när det gäller att skapa en hög specificitet hos reaktionen.

Analysen av DNA fragmenten som genererats i en PCR reaktion sker oftast med gelelektrofores av olika slag.

Gelelektrofores

Gelelektrofores separerar DNA molekyler med avseende på deras längd i baspar. För att separera DNA använder man sig av agaros- eller akrylamidgeler och separationen sker med hjälp av likström. Agaros och akrylamidgeler kan man se som ett nät. Ju högre koncentration gelen har desto finmaskigare nät. Kortast fragment rör sig snabbast i spänningsfältet medan långa fragment har svårt att förflytta sig i gelnätverket. Kapillärelektrofores innebär att man använder sig av en mycket tunn kapillär som innehåller en akrylamidliknande vätska. Proverna får vandra i ett elektriskt fällt avläses med hjälp av en laserkamera som är kopplad till en dator.

I och med att en primer i varje primerpar är inmärkt med en fluorofor får vi provets olika alleler direkt i dataform. Genom att dessa alleler jämförs med en allel-stege, dvs de alleler som finns för varje undersökt loci får vi ett liknande resultat. När man kör kapillärelektrofores analyseras ett prov/kapillär. Maskiner finns idag med 96-kapillärer vilket innebär att 96 prov kan analyseras åt gången. Själva gelforesen går snabbt, ca 30 minuter/prov. Dessutom kopieras en region upp som är specifik för X-kromosomen och en region för Y-kromosomen. Det innebär att man kan skilja man från kvinna i analysen.

När en DNA analys har utförts måste man göra beräkningar för att se hur stor sannolikhet det är att få just de alleler man har. För att kunna utföra den beräkningen måste man veta hur vanliga allelerna är i populationen. Tabell 6.4 visar på ett loci där det finns 5 olika alleler (2, 3, 4, 6 och 8). Var och en finns i en viss frekvens i en referenspopulation t ex allel två har frekvensen 0,36 dvs 36 % av allelerna i populationen är allel 2 osv.

Först lite Mendelsk Genetik och Hardy-Weinbergs lag.

Antag att du har två heterozygota individer Aa x Aa. Hur kommer deras avkomma att kunna se ut. Allelerna i gameterna kommer antingen att vara A eller a, om sedan dessa alleler paras ihop slumpmässigt kommer följande genotyper att vara möjliga.

Tabell 1. Korsningsschema som ger andelen olika genotyper.

Det innebär att 50% av avkomman kommer att vara heterozygot och 25 % kommer att vara AA och 25 % kommer att vara aa. Det innebär att för ett locus där jag har två alleler kan frekvensen för de tre olika genotyperna bli:

• homozygot för A-allelen dvs AA detta innebär att frekvensen blir A x A (A²) eller p² .
• homozygot för a-allelen dvs aa detta innebär att frekvensen blir a x a (a²) eller q² .
• heterozygot Aa, detta innebär att frekvensen blir 2 x A x a eller 2pq.

Ovanstående korsningsschemas genotyper (tabell 1) kan således översättas till Hardy-Weinbergs lag (tabell 2).

Tabell 2. Genotypernas frekvens.

Eftersom alla individer är medräknade får vi att 1 = p² + 2pq + q² (Hardy-Weinbergs lag).

Nu kan vi göra sannolikhetsberäkningen på den data som finns. Man har bestämt fragmenten som finns i figuren med hjälp av ett analysprogram och funnit de genotyper som återfinns enligt; locus "D3S1358" (se tabell 3) har individen allelerna 15 resp 16 och de finns i frekvensen 0,28 resp 0,22. Eftersom individen är heterozygot får vi 2 x 0,28 x 0,22 = 0,123 osv. Multipliceras alla genotypfrekvenser för alla loci får vi sannolikheten för att ha just den genotypen (match probability), vilket ger oss 6 x 10¹³. Detta innebär att en person av 6 x 10¹³ har just denna profil och med tanke på att vi är ca 10⁹ individer på jordklotet bör bara en person ha just denna genotyp.

Tabell 3. Hardy-Weinbergs lag applicerade på loci med multipla alleler.

Faderskapsmål

I faderskapsmål vill man återfinna barnets alleler hos mamman resp pappan.

I locus "D3S1358" har exempelvis ett barn 16, 17 mamman har 15, 16. Dottern måste ha ärvt allel 16 från sin mamma, vilket innebär att hon ärvt 17 från sin pappa. En av de tilltänkta papporna har 13, 17 och matchar således dotterns ena allelfrekvens. Genom att jämföra alla loci kan man bestämma vem som är pappa. Förhoppningsvis ska matchningen bli 1.0 och om det finns avvikelser kan detta bero på att mutationer har skett. Trots att mutationer är högfrekventa i mikrosatellitloci bör inte mer än ett locus avvika från det förväntade.

Familjetestning

Precis som vi kan identifiera mamma, pappa och barn kan vi också identifiera andra familjemedlemmar. Vi bör hitta mer likheter inom familjen än mellan icke-besläktade individer.

Kvalitetskontroll

I alla försök måste positiva och negativa kontroller inkluderas. Är provet kontaminerat eller består av DNA från två eller flera personer kan oftast det också analyseras.

Analyserad och beräknad data använder sig av Hardy-Weinbergs lag. Denna lag förutsätter att:

• val av partner (parning) är slumpmässig inom populationen
• att populationen är stor
• att inte "kusingifte" sker
• det inte förekommer invandring eller utvandring

Vi inser väldigt snabbt att Hardy-Weinbergs lag i princip aldrig gäller "i verkliga livet", trots detta är det den lag populationsgenetikern använder sig av. Det har också visat sig att man kan förlita sig på den utom i extremfall, där inavel är betydande. När man beräknar sannolikheten att få just en speciell genotyp är frekvensen för olika alleler beräknad utifrån olika befolkningsgrupper t ex Kaukasier, Afro-amerikaner osv. Man ska ha i beaktande att i de flesta länder är befolkningsgrupper blandade och att "bland-äktenskap" förekommer. Vid den beräkning som gjordes i avsnitt 6.4 (6 x 10¹³) hamnar man på värden som långt överstiger hela jordens befolkning, vilket gör att man kan lita på sina värden trots Hardy-Weinbergs antaganden.

Y-kromosomanalys

Det finns mikrosatellitloci även på Y-kromosomen. I extrema fall (t ex vid gruppvåldtäkter) kan det vara bättre att analysera data från Y-kromosomen istället från autosomerna. Y-kromosomen nedärvs från fader till son osv och bevisningen blir sämre eftersom jag inte kan skilja fader ifrån son/söner. I stället för att analysera mikrosatellitloci kan man analysera SNP (single nucleotide polymorphism), dvs när en punktmutation sker som ger upphov till att en ensam bas förändras. Denna typ av identifiering ger "lägre upplösning", men är lättare att utföra och går att automatisera långt mer än då man arbetar med mikrosatelliter.

För en SNP finns 4 olika alleler, nämligen A, T, G och C. Man hittar SNPs varje 100-300 bas fördelat över hela genomet (totalt ca 1 milj. SNP). För att hitta allelvarianterna (A, T, G och C) kan DNA-sekvensering utföras. En variant av DNA-sekvensering är Minisekvensering. I ett antal provrör tillsätter man det DNA man vill undersöka. I varje provrör tillsätter man sedan olika primers som fäster in en bas ifrån SNPn. Genom att man också tillsätter DNA polymeras och fluoroscens-inmärkta nukleotider som är modifierade så att ingen mer nukleotid-inbindning tillåts kan man sedan efter elektrofores detektera vilken nukleotid som har bundet in till målsekvensen.

För att kunna skilja individer åt behövs åtminstone 50 SNP-ställen undersökas. Denna teknik är laboratorie-krävande men kan med fördel användas på DNA som har för dålig kvalitet för att testas mha mikrosatellitvariation.

Mitokondriellt DNA (mtDNA) analys

 Trots att mtDNA innehåller mindre genetisk variation än vad man finner i kärnans DNA har mtDNA sina fördelar. Kärn-DNA är inte alltid möjligt att utvinna från material som är nedbrutet t ex gamla ben, hårstrån och från förruttnade kroppar. MtDNA bryts också ner men eftersom det i varje mitokondrie finns flera genom och det i varje cell finns få till många mitokondrier är det oftast möjligt att utvinna DNA.

mtDNA

Humant mtDNA är cirkulärt och innehåller 16569 baspar. Mitokonrier nedärvs maternellt, alltså vi får vår cytoplasma och dess innehåll från ägget. Trots att spermien innehåller cytoplasma och mitokondrier hamnar detta inte i ägget. Konsekvensen av detta är att alla barn till en kvinna har samma mtDNA. I princip allt mtDNA är kodande vilket innebär att det finns mycket lite DNA variation. Finns det är variation är det ofta förknippat med sjukdom. Det finns trots detta en kontroll region (D-loop), vilken är involverad i replikation av mtDNA som är ca 1000 bp lång och som innehåller två hypervariabla regioner (HV1 och HV2).

Dessa kan variera i sekvens, oftast punktmutationer. Mitokondrier saknar DNA reparationssystem vilket gör att mtDNA muterar snabbare än vad kärnans DNA gör. I den hypervariabla regionen räknar man med att för varje 100 bp finns det tre SNPs. De hypervariabla regionerna sekvenseras och jämförs med ett referens sekvens, exempelvis en undersökning där man söker efter en persons (Anderson) släkting. Exemplet kan vara tagit ifrån en katastrof där många kroppar behöver identifieras. Genom att sekvensera mtDNA från de funna kropparna och sedan jämföra dessa med referensen kan man hitta Andersons släkting/släktingar.

I detta exempel kan vi förvänta oss att kropp 2,3 och 5 är släkt med Anderson. För säkrare identifiering behöver fler undersökningar göras t ex mha mikrosatellitanalys.

Låg-kopie-antal DNA (LCN DNA) och känslighet

Det finns behov av att förfina tidigare nämnda metoder samt att framförallt möjliggöra analyser från material innehållande små mängder DNA (LCN DNA), t ex från finger- och läppavtryck. Med små mängder DNA ökar också risken för kontaminering. Det krävs stor försiktighet vid brottsplatsen och sedan i laboratoriet för att inte proven ska kontamineras av andra DNA spår. Länsligheten är så stor att bara genom att skaka hand med en person kan en individs DNA ”flytta sig” till platser där individen själv aldrig har varit.

Beräkning av humana microsateliter

I Storbritannien används en standard profil som grundar sig på ett system som kallas AmpFlSTRSGM Plus (Applied Biosystems), nedan kallat SGM⁺, vilket har utvecklats från ett system av Forensic Science Service of England och Wales. Systemet används däremot inte över hela världen, då andra länder har system som skiljer sig i antalet. De allmänna principerna är dock de samma för alla system. I SGM⁺ systemet utvinns och kvantifieras DNA med hjälp av PCR, där Högskolan Kristianstad använder en form av PCR med tre primers som används för att amplifiera ett lokus.

SGM⁺ systemet förstärker simultant 11 olika loci. I huvudsak finns det (9 + 2) PCR som äger rum i samma rör, det finns tre specifika primers för var och en av de 11 loci. Anledningen till att undersöka 11 loci är att det ökar särskillnaden av analyserna, dvs. ju fler ställen som undersöks, desto mindre troligt är det att två personer delar samma kombination av alleler. De loci som börjar med ´D´är inte delar av gener och är namngivna enligt reglerna för namngivning av DNA-segment. 'D'står för DNA och följande antal anger var kromosomen på den särskilda sekvensen gå att finna. 'S' beskriver en unik sekvens och numret identifierar den särskilda sekvensen.

Observera att allelfrekvenserna nedan inte tar någon hänsyn till etnicitet, dvs. allelfrekvenserna kan skilja sig något beroende på vilken befolkningsgrupp man tillhör!

Tabell 4. Allelhögfrekvenser hos befolkningen av 9 loci i AmpFISTRSGM Plus-systemet.

Med hjälp av Hardy-Weinberg-principen som beskrivits tidigare kan DNA-profilen analyseras med hjälp av data från tabeller med allelfrekvenser för loci i SGM⁺-systemet. I grund och botten beräknas den förväntade genotypfrekvensen för varje lokus som tabeller med populationsdata för loci. Det finns en rad genotypfrekvenser. För TH01 kan 123 personer av 1000 eller fler än 1 av 10 förväntas ha den särskilda genotypen. Individuellt är dessa genotyper inte särskilt diseriminerande. Dessa värden visar hur vanlig den observerade genotypen för det specifika locuset förväntas vara i befolkningen.

För att uppskatta hur vanligt hela profilen sannolikt kommer att vara, multipliceras genotypfrekvenserna för loci enkelt tillsammans. Detta gäller eftersom loci alla finns på olika kromosomer, och arvet av en genotyp har ingen inverkan på arvet hos andra alleler på olika ställen. Följaktligen förväntas frekvensen av DNA-profilen i befolkningen i tabell 5 i, vara 0,123 * 0,057 * 0,024 * 0,029 * 0,123 * 0,067 * 0,042 * 0,004 * 0,123 * 0,020 = 1,66 * 10^-14. Detta representerar en anmärkningsvärd låg frekvens. Sannolikheten för identitet) är 1 / (1,66 * 10-14) = 6 * 10¹³.

Detta kallas också sannolikheten för DNA-matchning. Effektivt innebär detta att sannolikheten i detta fall överstiger jordens befolkning. Sådana imponerande stora antal måste emellertid behandlas med viss försiktighet. Statistiken avser inte släktingar i befolkningen. Det är mer sannolikt att släktingar delar alleler än att de som inte är släktingar delar alleler, och därmed är sannolikheten för en profilmatch mellan släktingar större. Dessutom är DNA-profilen för alla människor på jorden inte känd, och även om det kan vara statistiskt osannolikt att två personer skulle kunna dela samma DNA-profil, kan man inte helt säga att DNA-profilen är unik

Tabell 5. Genotyp frekvenser av loci i DNA-profilen.

Resultat och analys

Dessa data relaterade till DNA-profilen i tabell 5 kan också presenteras som ett sannolikhetsförhållande, där sannolikheten för alternativa händelser jämförs. I det här fallet med det observerade DNA-profilbeviset, skulle hypotesen vara åtalsargumentet, och att den misstänkte lämnade bevisen vilket gör att profilerna matchar. Om hypoteserna är sanna är sannolikheten för denna matchning 1,0. Den alternativa möjligheten är att bevisen kommer från en annan person, dvs. försvarets linje. Denna sannolikhet från STR⁺-datan är 1,66 * 10^-14.

Sannolikhetskvoten är således lika med 1 / (1,66 * 10^-14) = 6 * 10¹³, som har samma värde som sannolikheten för DNA-matchningen, men dess innebörd är annorlunda; Det betyder att hypotesen att bevisen ursprungligen kommer från den misstänkte är 6 * 10¹³ gånger mer sannolikt än det motsatta alternativet. Anledningen till att använda 10 loci är att varje enskilt locus inte är särskilt diskriminerande, eftersom vissa av deras alleler är mycket vanliga, blir DNA-profilen mycket diskriminerande på grund av multipliceringen av många låga sannolikheter.

Det är därför mer sannolikt, men inte säkert, att profilen endast finns hos en person . Av flera orsaker kan den beräknade sannolikheten vara en underskattning, men STR⁺-systemet är fortfarande mycket kraftfullt i sin utformning.